Entre os loricariídeos, o gênero Hypostomus Lacépède, 1803 é amplamente distribuído pela América do Sul. Hypostomus isbrueckeri distingue-se de todas as outras espécies de Hypostomus por uma série de características. Estudar a existência de polimorfismo cromossômico na espécie H. isbrueckeri através de técnicas citogenéticas clássicas como a coloração por Giemsa e impregnação por nitrato de prata é importante no entendimento da evolução deste complexo grupo de peixes. Hypostomus isbrueckeri foi analisado através de técnicas citogenéticas convencionais. Hypostomus isbrueckeri (dezoito machos e cinco fêmeas) foram coletados no rio das Antas, bacia do rio Uruguai, Mondaí - Santa Catarina. Hypostomus isbrueckeri apresentou número diploide de 76 cromossomos, com 22m-sm+54st-a. A espécie apresentou heterocromatina predominantemente nas regiões teloméricas e centroméricas dos cromossomos. Nestes indivíduos, embora o número diploide fosse o mesmo (76 cromossomos), a formula cariotípica observada foi distinta, com 23m-sm+53st-a. A análise através da impregnação por nitrato de prata demonstrou a ocorrência de um único par portador de RONs na maior parte dos indivíduos, na região terminal de um par de cromossomos acrocêntricos. Porém, nos indivíduos que apresentaram polimorfismo cromossômico, o cromossomo metacêntrico que caracterizou o polimorfismo sempre apresentou marcações por nitrato de prata, indicando sítios de DNA ribossomal ativos nesse cromossomo. Assim demostrando que a atividade destes genes não foi afetada por sua dispersão para este cromossomo. Neste contexto, a análise de polimorfismos cromossômicos demonstra, em pequena escala, como a ampla variabilidade de fórmulas cromossômicas e números diploides pode ter surgido neste grupo.