OBJETIVO: Astyanax é considerado atualmente um táxon polifilético, possuindo espécies crípticas, o que dificulta na identificação e no estabelecimento de relações filogenéticas dentro do gênero. Astyanax bimaculatus possui como característica principal a presença de uma mancha umeral negra horizontalmente ovalada, duas barras verticais marrons e uma mancha negra no pedúnculo caudal. O objetivo do presente trabalho é analisar, utilizando métodos citogenéticos clássicos, exemplares de Astyanax bimaculatus oriundos do Lago de Itaipu e compara-los com os já descritos. MÉTODOS: Foram capturados, com tarrafas e peneiras, 10 indivíduos de A. bimaculatus em um tributário do lago de Itaipu (Alto Paraná III), seis fêmeas e quatro machos, analisando-se cerca de oito metáfases por indivíduo. Para a caracterização citogenética foram utilizadas a coloração convencional por Giemsa, bandamento C e impregnação por nitrato de prata (Ag-NORs) RESULTADOS: As análises mostraram que, para esta espécie, foi caracterizado o número diplóide de 50 cromossomos, com bandas pálidas centroméricas nos pares 11, 14, 15, 16, 20, 21 e 22, conspícuas teloméricas no par 18, e NOR em apenas um cromossomo do par 14. CONCLUSÕES: Este estudo corrobora com a compreensão do complexo A. bimaculatus, possibilitando um melhor entendimento para identificação de espécies, sua conservação e proteção.