O mapeamento físico, por hibridização in situ fluorescente (FISH), do gene ribossomal 5S, vem sendo utilizado com grande frequência em estudos citogenéticos em peixes neotropicais, por auxiliar na resolução de problemas de ordem taxonômica, biogeográfica e filogenética. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo, realizar um mapeamento físico por FISH, do DNA ribossomal 5S em populações de Astyanax bimaculatus. Os espécimes foram coletados em pisciculturas na região de Santa Helena e em tributários do Lago de Itaipu, na bacia do Paraná III, com auxílio de redes e tarrafas, e transportados vivos para o Laboratório de Ictiologia e Limnologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Câmpus Santa Helena, onde foram mantidos em aquários até serem eutanasiados para obtenção da suspensão celular. Os cístrons de rDNA 5S nos cromossomos foram mapeados usando hibridização in situ fluorescente, a sonda de rDNA 5S foi marcada com digoxigenina-11dUTP (DIG-Nick Translation Mix – Sigma-Aldrich®) e o sinal de detecção foi antidigoxigenina-rodamina. Foram observados cístrons simples de rDNA 5S na população da piscicultura Santa Helena, Linha São Gabriel e piscicultura Cerâmica na posição pericentromérica/centromérica no par metacêntrico 3, na população próxima a Sanepar foram observadas marcações de rDNA 5S na posição pericentromérica/centromérica do par metacêntrico 3 e na posição centromérica/pericentromérica do par acrocêntrico 22. O rDNA 5S é um excelente marcador taxonômico para Astyanax porém novas análises taxonômicas devem ser realizadas para confirmar se a variação encontrada é populacional ou trata-se de unidades biológicas distintas, visto que A. bimaculatus é um complexo de espécies.