O presente estudo teve como principal objetivo a realização da otimização e validação quantitativa de uma metodologia para separação dos principais marcadores químicos (ácido cafeoilquínico, ácido cafeico, rutina, isoquercetina e astragalina) encontrados nas folhas da Moringa oleífera, por meio da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Após a otimização da metodologia foram avaliados os efeitos do estádio de maturação e dos fatores sazonais nos teores desses compostos em plantas cultivadas nos estados de Santa Catarina, São Paulo e Bahia. Os resultados obtidos para os parâmetros de validação, linearidades e os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), apresentaram resultados satisfatórios (R² ≅ 0,99; LD variando de 0,004 a 0,740 e LQ de 0,012 a 2,467).  Por meio dos ensaios realizados, foi possível constatar diferenças significativas nos teores encontrados para esses fenólicos, em decorrência das regiões de cultivo e estações do ano em que a colheita foi realizada. A região sul foi aquela com maior influência positiva para os teores de ácido cafeoilquínico, ácido cafeico e astragalina e a região nordeste, juntamente com a estação do ano verão apresentou os tratamentos mais influentes para os teores de isoquercetina. Para a rutina, nenhum tratamento apresentou diferença mínima significativa.